Illumina 라이브러리 준비 키트에 대한 DNA/RNA 분리 고려 사항
09/03/21
다양한 DNA 및 RNA 샘플 유형과 추출 방법은 효소 반응에 억제제를 도입할 수 있습니다. 억제제는 적절하게 제거되지 않으면 역전사, 말단 복구, A-테일링, 어댑터 라이게이션 및 PCR을 포함한 많은 유형의 효소 반응에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 게시판은 Illumina 라이브러리 준비 키트로 라이브러리를 준비하기 전에 DNA 및 RNA의 분리 및 정제에 대한 중요한 고려 사항을 간략하게 설명합니다.
우려되는 억제제는 무엇입니까?
일부 억제제 또는 오염물은 혈액 내 헤모글로빈 또는 식물 샘플 내 습성/풀브산과 같은 샘플 유형 또는 샘플 소스에 내재되어 있습니다. EDTA, 헤파린 또는 페놀:클로로포름과 같은 다른 것들은 샘플 처리 또는 추출 방법을 통해 도입됩니다.
억제제는 효소가 표적 기질에 결합하는 것을 방지하거나(즉, DNA/RNA를 코팅하여 효소 결합을 방지하는 단백질), 효소 기능을 감소시키거나 효소 자체를 분해할 수 있습니다(예: 단백분해효소, 세제, 페놀 및 pH).
DNA/RNA 샘플에서 오염물이 의심되거나 검출되면 어떻게 하나요?
효소 억제 또는 성능 저하를 방지하는 가장 좋은 방법은 신중한 샘플 취급과 억제제가 없는 핵산을 효율적으로 정제하도록 최적화된 추출 프로토콜을 결합하는 것입니다. 핵산을 용리 또는 재현탁한 후 샘플의 최종 pH는 7.0~8.5 범위 이내여야 합니다.
Illumina는 순도 평가를 위한 UV 분광광도법과 핵산 정량화를 위한 Qubit 또는 Pico/RiboGreen과 같은 형광 기반 방법을 권장합니다. 용액 내 핵산의 순도를 평가하는 가장 일반적인 방법은 UV 분광광도법으로 260/280 및 260/230 비율을 측정하는 것입니다.
다양한 샘플 유형에서 어떤 억제제가 발견됩니까?
|
샘플 소스 억제제 |
억제 효과 | 가능한 출처 | 억제를 최소화하는 방법 |
|---|---|---|---|
| 다당류 |
템플릿 차단 |
식물 |
고염분 침전, CTAB 완충액, 클로로포름 추출, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, α-아밀라아제 소화 |
| 단백질 |
템플릿 차단 |
피부, 결합 조직, BSA, 면역글로빈 |
SDS, CTAB 또는 구아니디늄 완충액, 단백질분해효소 K, 실리카 기반 정제 |
| 지방 |
템플릿 차단 |
지방 조직; 글리세롤 |
Upase 또는 Hexane 처리 및 Chloroform 추출, 실리카 기반 정제 |
| 담즙염 |
템플릿 차단 |
대변, 대변 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
| 콜라겐 |
템플릿 차단 |
피부, 결합 조직 |
SDS, CTAB 또는 구아니디늄 완충액, 단백질분해효소 K, 실리카 기반 정제 |
| 헴 |
경쟁 MgCl2 |
혈액 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
| 휴름산 |
킬레이트화 금속 이온 |
토양, 식물 재료 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
|
멜라닌 및 유멜라닌 |
효소 결합/ 템플릿 차단 |
모발, 피부 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
| 미오글로빈 |
킬레이트화 금속 이온 |
근육 조직 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
|
복합 다당류 |
템플릿 차단 |
대변, 식물 재료 |
고염분 침전, CTAB 완충액, 클로로포름 추출, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, α-아밀라아제 소화 |
| 단백질분해효소 |
템플릿 차단 |
우유 |
템플릿 역할을 하지 않거나 선형 아크릴아미드, N- 또는 P-캐리어와 같은 템플릿 |
| 칼슘 이온 |
경쟁 MgCl2 |
우유, 뼈 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
| 요소 |
효소 변성 |
소변 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
|
헤모글로빈, 락토페린 |
경쟁 MgCl2 |
혈액 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
|
면역글로빈 G (IgG) |
템플릿 차단 | 혈액 |
SDS, CTAB 또는 구아니디늄 완충액, 단백질분해효소 K, 실리카 기반 정제 |
|
인디고 염료 탄닌산 |
템플릿 차단 | 특정 식물 | 70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
다양한 샘플 치료/추출 방법에서 어떤 억제제가 발견됩니까?
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치료/추출 방법 캐리오버 |
억제 효과 | 가능한 출처 | 억제를 최소화하는 방법 |
|---|---|---|---|
| EDTA |
킬레이트화 금속 이온 |
TE 버퍼 |
TE 버퍼에서 EDTA 농도를 줄이거나 Trs-HCl(10mM)을 사용하면 됩니다. 또는 용리 완충액으로서 뉴클레아제 유리수 |
| 알코올 | 효소 변성 |
에탄올 이소프로판올, 이소아밀 알코올 |
건조 펠릿 및 재현탁 또는 실리카 기반 정제 사용 |
| 과도한 소금 |
템플릿 차단 |
KC; NaCl, CsCl, NaAc |
70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
| 향야성 소금 | 효소 변성 |
구아니디늄 클로라이드 염화마그네슘, 요소 |
70% 에탄올로 세척하거나 실리카 기반 정제 사용 |
| 페놀:클로로포름 | 효소 변성 | 유기 캐리오버 |
PVP, PVP/아세트산암모늄, 통합 사용 DNA 추출 단계에서 1.2% 구연산 |
| 세제/DDT | 효소 변성 |
데옥시콜레이트 나트륨, SDS, Tween 20, Triton X-100 |
70% 에탄올로 세척 |
| 프로테아제 | 단백질 분해 | 단백질분해효소 K | 페놀:클로로포름 ext에 이어 실리카 기반 정제 |
| 뉴클레아제 | 템플릿 성능 저하 |
제한 효소, 마이크로콕쿠스 뉴클레아제, S1 |
단백질 침전 중에 B-ME, EGTA 또는 SDS 사용 |
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외인성 DNA/RNA |
템플릿 경쟁 | 이월 | DNA 제거를 위한 DNase I, RNA, RNA:DNA 하이브리드 제거를 위한 RNase A |
| 운송업체 |
템플릿 경쟁/차단 |
RNA, 헤파린, 글리코겐 |
템플릿 또는 선형 아크릴아미드, N- 또는 P-캐리어와 같은 템플릿 차단 |
| 아가로스 |
템플릿 차단 |
겔 추출 | 스핀 컬럼을 카오트로픽 염 완충액과 함께 사용, 투석 |
| 과잉 금속 이온 | 올리고 특이성 감소 |
최저 Mg++ PCR 버퍼 |
PBS(pH 7.4), 페놀:콜로폼 추출에 대한 투석 EtOH 침전 후 |
DNA/RNA 샘플에서 오염 물질을 어떻게 제거하나요?
샘플에 다운스트림 효소 반응에 영향을 미치는 오염물이 있는 경우, 필터 기반 스핀 컬럼 재정제와 같은 추가 정제 단계가 오염물 제거 및/또는 샘플 농도에 도움이 될 수 있습니다.
이 목록에는 효소 반응의 모든 가능한 억제제가 포함되지는 않지만, 샘플 소스 또는 샘플 처리/추출 방법에서 유래한 가장 일반적인 오염 물질이 포함됩니다.