포르말린 고정 파라핀 포매(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 추출 방법은 일반적으로 고도로 분해된 DNA 및 RNA를 산출하며, 이는 라이브러리 준비 프로토콜에 어려움을 제기합니다. FFPE 샘플이 다운스트림 library preparation kit 유형에 적합한 투입 재료인지 여부를 확인하려면 Illumina는 FFPE 품질 관리 단계를 수행할 것을 권장합니다.

다음은 FFPE 지원 라이브러리 준비 키트 및 각각의 품질 관리 단계입니다.

DNA 시퀀싱 – 전장 엑솜

Illumina DNA Prep with Enrichment(구 Nextera Flex for Enrichment)

• 샘플 품질을 평가하려면 다음 사항이 모두 필요합니다.
• Infinium FFPE QC 키트 (Illumina 카탈로그 번호 WG-321-1001)(사용자 제공)
• KAPA qPCR master mix(Universal) 및 Primer Premix(사용자 제공)
• Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System 또는 이와 동등한 기기(사용자 제공)
• ∆Cq 값이 ≤ 5인 FFPE 샘플의 경우 권장 DNA 입력값은 50~1000 ng입니다.
• Illumina DNA Prep with Enrichment 키트는 ∆Cq > 5인 샘플과 함께 사용하지 않는 것이 좋습니다.
• ∆Cq > 5인 샘플을 사용하는 것은 가능하지만 라이브러리 준비 실패 가능성을 높이거나 assay 성능을 저하시킬 수 있습니다.
• 추출된 FFPE 샘플 입력의 경우 라이브러리 준비 프로토콜의 “Amplify Tagmented DNA” 단계에서 PCR 주기를 12로 늘립니다.

TruSeq DNA 엑솜

• FFPE QC는 필요하지 않습니다.
• 유전체 품질 번호(GQN)에 따라 FFPE DNA 입력을 조정합니다.
• GQN 값이 ≥ 0.3인 샘플에 대한 라이브러리 수율을 높이려면 프로토콜의 첫 번째 증폭에서 PCR 주기를 12사이클로 늘리십시오.
• 인리치먼트에 사용되는 각 라이브러리의 양을 초기 투입량에 관계없이 500 ng으로 늘립니다.
• 이전 권장 사항에 대한 자세한 내용은  FFPE 샘플의 DNA 품질 평가 기술 노트를 참조하십시오.

표적 DNA 시퀀싱

AmpliSeq for Illumina Panels(사용 준비 완료): BRCA Panel , Cancer Hotspot Panel v2,  Childhood Cancer Panel , Comprehensive Panel v3, Comprehensive Cancer Panel, Focus Panel 및 TCR beta-SR Panel ; AmpliSeq for Illumina Custom DNA Panel (맞춤형 패널)

• AmpliSeq 키트에는 FFPE QC가 필요하지 않습니다.
• 최대 지원 양의 투입 DNA를 초과하지 마십시오.
• 1 ng DNA는 고품질의 잘 정량화된 샘플에만 사용하십시오.

TruSight 종양 15

• FFPE 품질 관리(QC)는 필요하지 않습니다.
• 종양 함량이 최소 30%인 최소 140 mm² 의 비흑색종 조직을 사용합니다.
• 검증된 FFPE 추출 키트 사용:
• AllPrep DNA/RNA FFPE 키트(QIAGEN)
• QIAamp DSP DNA FFPE 조직 키트(QIAGEN)
• ReliaPrep FFPE gDNA MiniPrep 시스템(Promega)
• 자세한 내용은 TruSight Tumor 15 참조 가이드의  FFPE DNA 추출 섹션을 참조하십시오.

RNA 시퀀싱 – 전 전사체/엑솜

Ribo-Zero Plus가 포함된 Illumina Stranded Total RNA

• DV200 > 55%로 10~100 ng의 FFPE RNA 입력을 사용합니다.
• 자세한 내용은  FFPE 샘플에서 RNA 품질 평가 기술 노트를 참조하십시오.
• 라이브러리 준비 프로토콜의 “라이브러리 증폭” 단계에서 추출된 FFPE 샘플 입력에 대해 PCR 사이클을 2 증가시킵니다.

TruSeq Stranded Total RNA

• Agilent RNA 6000 Nano Kit(파트 #  5067-1511)를 사용하여 2100 Bioanalyzer Desktop System(Agilent Technologies, 파트 # G2940CA)으로 FFPE RNA 품질을 평가합니다.
• 또는 표준 민감도 RNA 분석 키트(20 nt Lower Marker)(Advanced Analytical Technologies, 파트 # DNF-489)를 사용하여 Fragment Analyzer Automated CE 시스템(Advanced Analytical Technologies, 파트 #  FSv2-CE2 또는 FSv2-CE10)으로 FFPE RNA 품질을 평가합니다.
•  TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide의 Modify RNA Fragmentation Time for Degraded RNA 섹션에 따라 절편화 시간을 조정합니다.

TruSeq RNA Exome

• DV200 값에 따라 FFPE RNA 투입량을 조정합니다. RNA 투입량을 조정하면 품질이 낮은 FFPE 샘플에서 고품질 라이브러리를 준비할 수 있습니다.
• 자세한 내용은  FFPE 샘플에서 RNA 품질 평가 기술 노트를 참조하십시오.

표적 RNA 시퀀싱 – 고정 및 맞춤형 패널

Illumina RNA Prep with Enrichment

• DV200 ≥ 36.5와 함께 20~100 ng FFPE RNA 입력을 사용합니다.
• 자세한 내용은  FFPE 샘플에서 RNA 품질 평가 기술 노트를 참조하십시오.
• 추출된 FFPE 샘플 입력의 경우 라이브러리 준비 프로토콜의 “Tagment cDNA” 단계에서 PCR 주기를 17로 늘립니다.

TruSight Pan Cancer

• TruSeq RNA Exome 경우 DV200 값에 따라 FFPE RNA 투입량을 조정합니다.
• 자세한 내용은  FFPE 샘플에서 RNA 품질 평가 기술 노트를 참조하십시오.

TruSight RNA Fusion

• DV200 값에 따라 FFPE RNA 투입량 조정
• 자세한 내용은  FFPE 샘플에서 RNA 품질 평가 기술 노트를 참조하십시오.

AmpliSeq for Illumina Panels: 전사체 인간 유전자 발현 패널, 면역 반응 패널 및 AmpliSeq for Illumina Custom RNA Panel

• 각 역전사 반응에는 DNase 처리 총 RNA 1~100 ng이 필요합니다. 권장 투입량은 RNA 10 ng입니다.
• 고품질의 잘 정량화된 샘플에만 총 RNA 1 ng을 사용하십시오. Illumina는 Qubit을 사용하여 입력 RNA를 정량화할 것을 권장합니다. UV-분광계 기반 방법은 사용하지 마십시오.
• 라이브러리 수율은 FFPE RNA와 같은 분해된 라이브러리 샘플의 경우 더 낮을 수 있습니다.

표적 DNA/RNA 시퀀싱 – 고정 패널

TruSight Tumor 170

• 충분한 핵산 물질을 얻으려면 최소 2 mm³ 의 FFPE 조직에서 핵산을 분리하는 것이 좋습니다.
• FFPE 품질에 따라 입력을 조정해야 할 수 있습니다. 자세한 내용은 TruSight Tumor 170용 FFPE 샘플의 DNA 및 RNA 품질 평가 백서를 참조하십시오.
• QIAGEN AllPrep DNA/RNA FFPE 키트는 핵산 추출에 권장됩니다.
• DNA
• FFPE 샘플 품질을 확인하기 위해 Illumina FFPE QC 키트(WG-321-1001)가 권장됩니다.
• ∆Cq 값이 ≤ 5인 DNA 샘플 사용을 권장합니다. ∆Cq > 5인 샘플은 assay 성능을 저하시킬 수 있습니다.
• RNA
• RNA 샘플 품질은 Advanced Analytical Technologies Fragment Analyzer(Standard Sensitivity RNA Analysis Kit) 또는 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Nano Kit)를 사용하여 평가할 수 있습니다.
• DV200 값이 ≥ 20%인 RNA 샘플 사용을 권장합니다. DV200 값이 < 20%인 샘플을 사용하면 assay 성능이 저하될 수 있습니다.

TruSight Oncology 500 및 TruSight Oncology 500 High Throughput(HT)

• 충분한 핵산 물질을 얻으려면 최소 2 mm³ 의 FFPE 조직에서 핵산을 분리하는 것이 좋습니다.
• QIAGEN AllPrep DNA/RNA FFPE 키트는 DNA 추출에 권장됩니다.
• DNA 샘플은 Illumina FFPE QC 키트(WG-321-1001)를 사용하여 평가할 수 있습니다.
• ∆Cq 값이 ≤ 5인 DNA 샘플 사용을 권장합니다. ∆Cq > 5인 샘플은 assay 성능을 저하시킬 수 있습니다.

• RNA 샘플은 Advanced Analytical Technologies Fragment Analyzer™(Standard Sensitivity RNA Analysis Kit) 또는 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Nano Kit)를 사용하여 평가할 수 있습니다.
  • DV200 값이 ≥ 20%인 RNA 샘플 사용을 권장합니다. DV200 값이 < 20%인 샘플을 사용하면 assay 성능이 저하될 수 있습니다.

이전 섹션에는 FFPE 지원 라이브러리 준비 키트와 함께 FFPE 샘플 사용에 대한 품질 관리 요건 및 권장 사항이 요약되어 있습니다. 자세한 내용은 각 library preparation kit에 대한 지원 페이지를 참조하십시오.

이 게시판에 언급된 품질 관리(QC) 기법:

• DV200 값은 Bioanalyzer 또는 Fragment Analyzer로 계산한 RNA 절편 >  200개의 뉴클레오티드의 백분율입니다.
• Infinium FFPE QC 키트는 전향적 DNA 샘플의 품질을 평가하는 qPCR 기반 척도입니다.
  • Infinium FFPE Restore 키트는 위에 나열된 라이브러리 준비 키트와 함께 사용되지 않습니다. 이 키트는 분해된 FFPE DNA를 증폭 가능한 상태로 복원하기 위한 어레이 assay에만 사용됩니다.
  • FFPE DNA 적격성 평가에 대한 자세한 내용은 Infinium HD FFPE QC Assay Protocol을 참조하십시오.