다양한 RNA-Seq 실험 유형에는 다양한 시퀀싱 리드 길이와 깊이(샘플당 리드 수)가 필요합니다. 이 게시판은 RNA 시퀀싱 고려 사항을 검토하고 RNA-Seq 실험을 계획하기 위한 리소스를 제공합니다.
먼저 어떤 리소스를 참조해야 하나요?
RNA 시퀀싱의 경우 일반적으로 커버리지 대신 리드 깊이가 사용됩니다. 저발현 유전자를 검출하려면 리드 깊이의 증가가 필요할 수 있습니다. ENCODE 프로젝트(여기에 업데이트됨)에는 RNA-Seq 및 Small RNA 시퀀싱에 대한 데이터 표준이 있으며 이는 많은 프로젝트에 탁월한 리소스입니다.
Illumina는 실험 설계에 대한 최신 지침을 위해 귀하의 분야 및 유기체에 대한 주요 문헌을 참조할 것을 권장합니다.
샘플당 몇 개의 리드를 타겟팅해야 하나요?
리드 깊이는 RNA-Seq 연구의 목표에 따라 다릅니다. 대부분의 실험은 프로젝트 목표와 함께 유기체 복잡성 및 크기에 따라 샘플당 5~2억 개의 리드가 필요합니다.
- 고발현 유전자의 빠른 스냅샷을 찾고 있는 유전자 발현 프로파일링 실험은 샘플당 5~2,500만 개의 리드만 필요할 수 있습니다. 이러한 경우, 연구자들은 여러 RNA-Seq 샘플을 시퀀싱 런의 한 레인에 풀링하여 샘플의 높은 멀티플렉싱을 가능하게 할 수 있습니다.
- 유전자 발현에 대한 보다 전체적인 관점과 대체 스플라이싱에 대한 일부 정보를 찾는 실험에는 일반적으로 샘플당 3천만~6천만 개의 리드가 필요합니다. 이 범위는 mRNA/전장 전사체 시퀀싱을 위해 대부분의 출판된 RNA-Seq 실험을 포함합니다.
- 전사체에 대한 심층적인 관점을 얻거나 새로운 전사물을 조립하고자 하는 실험에는 1억~2억 개의 리드가 필요할 수 있습니다. 이러한 경우, 연구자들은 여러 고출력 시퀀싱 레인에서 여러 샘플을 시퀀싱해야 할 수 있습니다.
- 표적 RNA 발현에는 더 적은 리드가 필요합니다. 예를 들어, Illumina는 샘플의 높은 플렉시티 풀링과 호환되는 TruSight RNA Pan Cancer 및 TruSight RNA Fusion Panel에 대해 샘플당 3백만 개의 리드를 권장합니다.
- miRNA-Seq 또는 small RNA 분석 실험은 전장 전사체 시퀀싱보다 훨씬 더 적은 리드가 필요할 수 있습니다. 이 요건은 시퀀싱되는 조직 유형에 따라 크게 다릅니다. Illumina는 주요 문헌을 사용하여 샘플당 1~500만 리드의 범위로 필요한 리드 수를 결정할 것을 강력히 권장합니다.
한 번에 실행할 수 있는 샘플 수를 확인하려면 플로우 셀에서 생성된 리드 수를 샘플당 필요한 리드 수로 나눕니다.
- 플로우 셀당 리드 수/샘플당 리드 수=플로우 셀당 샘플 수
Coverage Calculator는 기기 및 사용 중인 시퀀싱 키트의 유형에 따라 주어진 런에 대해 얼마나 많은 샘플을 함께 풀링할지 계산하는 데 사용할 수도 있습니다.
리드의 길이는 얼마나 되나요?
리드 길이는 라이브러리의 애플리케이션 및 최종 크기에 따라 다릅니다. Library Prep Kit Selector는 각 유형의 RNA-Seq 라이브러리에 대한 리드 길이 지침을 제공합니다. 삽입 길이보다 긴 리드의 시퀀싱은 추가적인 유용한 데이터를 제공하지 않습니다.
- 유전자 발현/RNA 프로파일링 – 코딩 전사체를 정량화하려면 일반적으로 풀의 모든 RNA를 계수하면서 스플라이스 접합부 전반의 판독을 최소화하기 위해 짧은 단일 리드(종종 50~75 bp)가 필요합니다.
- 전사체 분석 – 새로운 전사체 조립 및 주석 프로젝트는 전사체에 대한 보다 완전한 커버리지와 새로운 변이 또는 스플라이스 부위의 식별을 가능하게 하기 위해 더 긴 페어드 엔드 리드(예: 2 x 75 bp 또는 2 x 100 bp)의 이점을 누리는 경향이 있습니다. 페어드 엔드 리드는 가닥형 RNA-Seq 라이브러리 준비 키트로 RNA 종의 5’ 및 3’ 엔드 모두에서 정보를 얻기 위해 필요합니다.
- 소형 RNA 분석 – small RNA의 짧은 길이로 인해 단일 리드(보통 50 bp 리드)는 일반적으로 전체 시퀀스를 포함합니다. 대부분의 작은 RNA에 50 bp 시퀀스의 리드 길이와 데이터 분석 중에 정확하게 식별하고 트리밍하기에 충분한 어댑터.
추가 리소스
RNA-Seq 실험 및 RNA-Seq 키트 옵션 계획 시 기타 고려 사항에 대한 자세한 내용은 Training 웹 사이트에서 녹화된 웨비나를 참조하세요. “Filters”에서 Training Type > Training and Videos > Online Training을 선택합니다.
RNA 시퀀싱 파트 I: Illumina의 RNA 라이브러리 준비 워크플로우 소개
RNA Sequencing Part II: Illumina의 RNA 준비 프로토콜 모범 사례
RNA 시퀀싱 파트 III: 분석 소개
소형 RNA-Seq 파트 I: 소개 및 파트 II: 모범 사례
Illumina 기기 사양: