어댑터 이합체란 무엇입니까?

BioAnalyzer 또는 Fragment Analyzer와 같은 칩 기반 모세관 전기영동 기기 또는 아가로스 겔을 사용한 시퀀싱 라이브러리의 품질 검사 중, 120~170 bp에서 예상치 못한 작은 피크는 어댑터 이합체의 존재를 나타냅니다(그림 1).

어댑터 이합체에는 플로우 셀에 결합하여 클러스터링하고 시퀀싱 데이터를 생성할 수 있는 전장 어댑터 시퀀스가 포함됩니다. 대조적으로, 프라이머 이량체는 완전한 어댑터 서열을 포함하지 않으며, 플로우 셀에 결합하거나 클러스터링할 수 없으므로 시퀀싱되지 않습니다.

어댑터 이합체의 원인은 무엇입니까?

• 불충분한 출발물질

너무 적은 투입 재료를 사용하면 어댑터 이합체 형성이 증가할 수 있습니다. 투입량의 정확성을 보장하기 위해 형광측정 기반 방법을 사용한 정량화가 권장됩니다. 워크플로우에 권장되는 범위 내에서 투입량을 사용하면 어댑터 이합체가 최종 라이브러리에 존재할 가능성을 최소화합니다.

• 출발물질의 품질 불량

특정 워크플로우에는 단편화되거나 분해된 입력 핵산을 사용하는 것이 권장되지 않습니다. 분해된 입력과 호환되지 않는 라이브러리 준비 방법에 분해된 입력 재료를 사용하면 어댑터 이합체로 이어질 수 있습니다.

• 비효율적인 비드 정리

라이브러리 준비 중에 형성될 수 있는 어댑터 이합체의 적절한 크기 선택 및 제거를 보장하기 위해 비드 취급 시 모범 사례를 따르는 것이 중요합니다.

어댑터 이합체를 제거하는 것이 왜 중요합니까?

어댑터 이합체에는 완전한 어댑터 시퀀스가 있으므로 클러스터링 및 시퀀싱이 가능합니다. 크기가 작기 때문에 의도한 라이브러리 조각보다 더 효율적으로 클러스터링됩니다. 특정 라이브러리에 대한 정량적 비율에 따라 원하는 라이브러리 단편에서 시퀀싱 리드의 상당 부분을 뺄 수 있습니다. 또한 시퀀싱 데이터 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 심지어 런이 조기에 중단될 수도 있습니다(그림 2).

어댑터 이합체를 어떻게 제거하나요?

어댑터 이합체가 라이브러리에 존재하는 경우, 비드(AMPure XP, SPRI 또는 Sample Purification bead, “SPB”) 또는 겔 정제로 추가 세척 단계를 수행합니다. 2차 정제는 라이브러리 수율을 감소시킬 수 있습니다. 일반적으로 0.8배~1배의 비드 비율이 권장되며 원치 않는 어댑터 이합체를 제거하기에 충분합니다.

어댑터 이합체는 어떻게 생겼나요?

그림 1. 어댑터 이합체 피크가 126 bp인 라이브러리를 보여주는 BioAnalyzer 전기영동도.

그림 2. 시퀀싱 중에 어댑터 이합체가 존재하는 경우, 이는 Sequence Analysis Viewer 또는 BaseSpace의 백분율 염기(%base) 플롯에서 명백합니다. 어댑터 이합체는 다음과 같은 시그니처를 제공합니다.

1. 다양성이 낮은 지역
2. 인덱스 영역
3. 다양성이 낮은 또 다른 지역
4. 어댑터 시퀀스가 끝나고 시퀀싱 리드가 플로우 셀로 흘러 들어갈 때 'A' 증가. 이 오버콜은 사용된 시퀀싱 플랫폼에 따라 G 오버콜일 수 있습니다.

오버콜 패턴은 의도된 라이브러리 단편과 비교하여 어댑터 이합체의 비율에 따라 다를 수 있습니다. 즉, 런에 더 낮은 비율의 어댑터 이합체로 덜 인식할 수 있습니다.