Quando si effettua il pooling delle librerie per il sequenziamento su sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq è imporante selezionare combinazioni di indici (index combinations) compatibili. In caso contrario, il sequenziamento delle Index Read può fallire a causa di errori nella registrazione dei cluster. Questo bollettino fornisce linee guida per il pooling delle librerie su sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq.

Sequenziamento a due canali

I sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq utilizzano due immagini, una nel canale rosso e una nel canale verde, per determinare le quattro basi del DNA (base calls). Invece di usare una colorazione fluorescente diversa per ogni base, il sequenziamento a due canali utilizza la combinazione di due colorazioni fluorescenti: rosso per C, verde per T, verde e rosso per A e nessuna colorazione per G.

Figura 1: Imaging del sequenziamento fluorescente a due canali (l’immagine delle colorazioni è un esempio a scopo illustrativo). Il rilevamento accelerato delle quattro basi del DNA viene effettuato, sui sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq, utilizzando due immagini per catturare la lunghezza d’onda nelle bande del rosso e del verde. Le basi nei cluster visualizzati unicamente nelle immagini del rosso o del verde vengono rispettivamente identificate come C e T. Le basi nei cluster visualizzate in entrambe le immagini del rosso e del verde vengono identificate come A, mentre le basi nei cluster che non presentano alcun segnale vengono identificate come G.

Considerazioni sugli indici

• La lettura degli indici (Index Reads) deve iniziare con almeno una base diversa dalla G in uno dei primi due cicli. Se una Index Read inizia con due basi G, non viene generato alcun segnale e la registrazione del cluster non verrà effettuata con successo. Almeno uno dei due primi cicli deve emettere un segnale per assicurare il demultiplexing.
• Selezionare gli indici con sequenza (index sequences) tale da generare, per ogni ciclo, un segnale in almeno un canale, o preferibilmente in due canali.
  • Canale rosso - A o C
  • Canale verde - A o T

Questo processo garantisce l’accuratezza nell’analisi dei dati.

Esempi di combinazione degli indici

Combinazione ideale degli indici: è presente un segnale in entrambi i canali per ogni ciclo.
 

Combinazione degli indice accettabile: è presente il segnale in un solo canale, ma il segnale è sufficiente per il sequenziamento.
 

Combinazione degli indici non accettabile: la registrazione del cluster non sarà possibile poiché la lettura dell’indice comincia con due basi G, pertanto nessun segnale verrà generato.
 

✔= Segnale in entrambi i canali. Notare che la rilevazione della base A è il risultato della fluorescenza nei canali del rosso e del verde.
✔= Segnale in un solo canale: combinazione accettabile.
✖= Segnale mancante in entrabi i canali.

Maggiori informazioni sul sequeziamento a due canali possono essere trovate alla pagina web 2-Channel SBS Technology.