최적의 클러스터 밀도를 달성하는 것은 MiniSeq, MiSeq, NextSeq 500/550 및 HiSeq 2500 시스템의 고품질 시퀀싱에 매우 중요합니다. 비패턴 플로우 셀에서 클러스터 밀도는 런 성능, 특히 데이터 품질 및 총 데이터 출력에 상당한 영향을 미칩니다. 언더클러스터링은 높은 데이터 품질을 유지할 수 있지만 데이터 출력이 낮아집니다. 또는 오버클러스터링은 런 실패, 런 성능 저하, Q30 점수 감소, 시퀀싱 아티팩트 도입, 총 데이터 출력 감소로 이어질 수 있습니다. 이 게시판은 언더클러스터링 및 오버클러스터링을 방지하고 보다 일관된 클러스터 밀도를 달성하기 위한 리소스와 모범 사례를 요약합니다.
- 라이브러리의 품질 검사 및 정확한 정량화는 매우 중요합니다. 이를 수행하지 않는 경우, 이는 일관되지 않은 클러스터 밀도의 가장 일반적인 원인입니다. 라이브러리 정량화 및 품질 관리 빠른 참조 가이드 게시판에 나열된 방법을 따라 Illumina 라이브러리를 확인하십시오.
- 최신 기기별 가이드라인에 따라 라이브러리를 희석하고 변성시킵니다.
- 라이브러리 변성 모범 사례:
- NaOH 원액은 희석 전에 pH가 >12.5여야 합니다. 희석하기 전에 원액의 pH를 확인합니다. 권장 스톡 농도는 해당 기기 시스템 가이드 또는 변성 및 희석 가이드에서 확인할 수 있습니다.
- 사용 시 항상 라이브러리 변성을 위해 새로 희석한 NaOH를 준비합니다.
- 소량 피펫팅 오류가 최종 NaOH 농도에 영향을 미치지 않도록 최소 1ml의 새로 희석된 NaOH를 준비합니다.
- 최상의 결과를 얻으려면 라이브러리를 변성 및 희석하기 전에 항상 시퀀싱 시약을 해동하십시오. 추가 지침은 기기 시스템 가이드와 게시판을 참조하십시오. 최적의 성능을 위해 시퀀싱 시약을 해동하고 보관하는 방법.
- 기기의 Denature and Dilute Libraries Guide 따르십시오.
- HiSeq 2500 및 MiSeq 시리즈의 경우, HT1로 희석한 후 NaOH의 최종 용액이 1 mM 이하의 NaOH인 것이 중요합니다. 1mM 이상의 NaOH는 템플릿 혼성화 효율성을 억제합니다.
- NextSeq 500/550 및 MiniSeq용 라이브러리를 변성할 때 200mM Tris-HCl pH 7.0을 사용하여 NaOH가 최종 용액에서 완전히 가수분해되었는지 확인합니다. 그 결과, 최종 NaOH 농도가 1 mM을 초과하더라도 템플릿 혼성화는 영향을 받지 않습니다(위의 NextSeq 500/550 및 MiniSeq 변성 및 희석 가이드 참조).
- 고도로 구조화되거나 GC가 풍부한 라이브러리의 경우, 풀을 기기에 로드하기 전에 라이브러리를 열 변성하면 클러스터 밀도 일관성이 향상됩니다. 이 방법은 다른 라이브러리의 경우 선택 사항입니다.
- 시퀀싱 라이브러리의 NaOH 변성 및 HT1에서 최종 로딩 농도로 희석한 후, 가열 블록을 사용하여 희석된 라이브러리를 96°C에서 2분 동안 배양합니다.
- 가열 배양 후 튜브를 1~2회 뒤집어 혼합합니다.
- 라이브러리를 5분 동안 얼음물 수조로 빠르게 옮깁니다. 빠른 냉각 단계는 라이브러리를 단일 가닥 형태로 잠그는 데 도움이 됩니다.
- 클러스터 생성으로 즉시 진행합니다.
- 라이브러리의 평균 크기를 고려하십시오. 클러스터링 프로세스는 단편의 혼합물에서 더 짧은 라이브러리를 우선적으로 증폭하기 때문에, 대형 라이브러리는 더 작은 라이브러리보다 덜 효율적으로 클러스터링하는 경향이 있습니다. Nextera Library Validation 및 Cluster Density Optimization 기술 노트에는 라이브러리의 평균 크기에 따라 로딩 농도에 대한 지침이 나열되어 있습니다.
- 일관된 클러스터 밀도와 우수한 데이터 품질을 보장하기 위해 저다양성 라이브러리를 시퀀싱할 때 특별한 고려가 필요합니다. 저다양성 시퀀싱 지침은 해당 기기에 대한 기술 노트를 참조하십시오. MiSeq , HiSeq , NextSeq 500/550 및 MiniSeq .