신선/냉동 검체 대 FFPE 검체에 대한 Infinium HD 메틸화 분석 워크플로
01/05/2023
신선/냉동 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 여부에 관계없이 Infinium HD 메틸화 분석에 사용되는 모든 DNA 검체는 Zymo 중아황산염 전환 키트(수정된 임상시험 계획서 포함)가 필요합니다.
FFPE 검체에는 Infinium FFPE QC Assay 및 Infinium HD FFPE DNA 복원 키트도 필요합니다. 이 회보는 신선/냉동 대 FFPE DNA 검체의 워크플로 차이를 설명합니다.
- 원하는 키트를 사용하여 DNA를 분리한 후, 이중 가닥 DNA의 정확한 측정을 보장하기 위해 형광측정 방법(예: PicoGreen, Qubit)을 사용하여 DNA를 정량화합니다.
참고: 이 단계에서 정확한 DNA 정량화가 중요하다. 중아황산염 전환 후, 모든 후속 단계는 부피로만 처리되며, 이 시점에서 DNA 투입이 정확하게 측정되었다는 가정에 의존합니다. - 검체 품질을 평가한다(FFPE만 해당). 인간 검체의 경우, Infinium FFPE QC 키트와 선택한 녹색 형광 염료가 포함된 qPCR 키트를 사용하여 DNA 품질을 확인합니다. Illumina는 델타 Ct(또는 델타 Cq) < 5인 샘플만 진행할 것을 권장합니다(QC 프로토콜 참조).
- 모든 검체 유형의 중아황산염 변환을 수행합니다. Zymo 중아황산염 전환 키트에 권장되는 DNA 입력(표 1의 승인된 키트 참조):
신선/냉동: > 250 ng(수동) 또는 1000 ng(자동)
FFPE: ≥ 250 ng(최대 1000 ng)
참고: 최상의 결과와 재현성, 특히 FFPE 검체의 경우, 500 ng과 같이 > 250 ng의 DNA 사용을 권장합니다.
Zymo 프로토콜 부록에 명시된 바와 같이 열 순환기 프로그램(제1일 종료)에 대한 다음과 같은 중요한 조정과 함께 카탈로그 번호 D5004, D5001 또는 D5002에 대한 Zymo 중아황산염 변환 프로토콜을 따라 주시기 바랍니다.
16주기 동안 다음과 같이 검체를 배양합니다.
• 95°C에서 30초
• 50°C에서 1시간
그런 다음, 제2일에 대한 Zymo 중아황산염 전환 프로토콜을 진행할 준비가 될 때까지 4°C에서 유지합니다.
Zymo에서 제공한 12µ리터(수동) 또는 22리터(자동) 완충액에 중아황산염 변환 검체(신선/냉동 및 FFPE)를 µ 용리합니다. - DNA 검체를 복원합니다(FFPE만 해당). Infinium HD FFPE DNA 복원 키트의 입력으로 전체 중아황산염 변환 용리액(~8µl)을 사용하고 복원 프로토콜을 따릅니다.
- Infinium Methylation Assay Amplify DNA 단계를 진행합니다.
신선/냉동 : Infinium HD 메틸화 프로토콜에는 MSA4 플레이트 제조 단계부터 시작하여 중아황산염 변환 DNA 입력 4µl를 사용합니다. MSA4
FFPE : MSA5 플레이트를 만드는 단계와 함께 Infinium HD FFPE Assay에 8µ리터의 복원 키트 용출액을 입력으로 사용합니다. DNA 재현탁 단계를 완료한 후, DNA를 BeadChip에 혼성화로 진행합니다.- 수동 프로토콜
- MethylationEPIC(8x1 BeadChips)의 경우 15µ리터가 아닌 Hyb 26µ리터를 사용해 주세요.
- 마우스 메틸화(12x1 BeadChips), Hyb 15 µl
- Tecan/IAPS를 사용한 자동 프로토콜: Illumina 자동화 제어(IAC) 소프트웨어에서 MSA4 작업을 선택하고 Hyb Multi-BC2로 진행합니다.
- MethylationEPIC BeadChip의 경우, 8-샘플 BeadChip 그림을 선택하고 Tip Guide-E를 사용하여 혼성화 해주시기 바랍니다.
- 마우스 메틸화 어레이의 경우, 가장 왼쪽의 12-샘플 BeadChip 그림을 선택하고 혼성화에 팁 가이드-B를 사용합니다.
- 자세한 내용은 Infinium HD 메틸화 분석 참조 가이드를 참조해 주시기 바랍니다.
- 수동 프로토콜
표 1 Infinium HD 메틸화에 필요한 추가 키트:
Illumina는 이 표에 나열된 Zymo Research 중아황산염 전환 키트만 검증하고 권장합니다. 나열된 모든 키트는 신선/냉동 DNA 검체와 호환됩니다.
| 제품명 | 사이즈 | 카탈로그 번호 | 다음에 대해 검증됨 FFPE 샘플? |
|
| Zymo 중아황산염 변환 키트 Illumina에서 승인 |
EZ-96 DNA 메틸화 키트 (딥 웰 형식) |
2 x 96 rxn | D5004 | 예 |
| EZ DNA 메틸화 키트 (스핀 열 형식) |
50 rxn | D5001 | 예 | |
| EZ DNA 메틸화 키트 스핀 열 형식) |
200 rxn | D5002 | 예 | |
| EZ-96 DNA 메틸화 조명 MagPrep 키트 (딥 웰 형식) |
4 x 96 rxn | D5046 | 아니요 | |
| EZ-96 DNA 메틸화 조명 MagPrep 키트 (딥 웰 형식) |
8 x 96 rxn | D5047 | 아니요 | |
| EZ DNA 메틸화-조명 자동화 키트 (딥 웰 형식) |
1 x 96 rxn | D5049 | 아니요 | |
| FFPE 검체 QC | Infinium FFPE QC Kit | 384 rxn | WG-321-1001 | 예(필수: FFPE 검체) |
| FFPE 검체 복원 | Infinium HD FFPE DNA 복원 키트 | 24 rxn | WG-321-1002 | 예(필수: FFPE 검체) |
추가 정보는 다음을 참조해 주시기 바랍니다.