Gli errori che avvengono dopo il primo ciclo di imaging sul MiSeq protrebbero indicare un’insufficiente instensità di segnale del cluster che, a sua volta, non consente allo strumento di trovare il piano focale corretto (best plane of focus).

Potenziali messaggi di errore (riportati in inglese sullo strumento):

• Best focus not found
• Best focus is too near the edge of range
• No usable signal found, it is possible clustering has failed
• Through-focus peak did not exceed SNR threshold
• Z Motor attempt to move outside soft limits

Possibili cause legate allo strumento includono:

• Scarsa distribuzione dei reagenti coinvolti nella generazione dei cluster, o nella chimica di sequenziamento della prima base
• Problemi nel controllo di temperatura della flow cell
• Problemi al sistema ottico (raro)

Possibili cause legate alla libreria e reagenti sono:

• Utilizzo di reagenti scaduti o non stoccati correttamente
• Problemi di design della libreria e/o di qualità/quantificazione
• Scarsa ibridzione del primer Read 1, dovuto a problemi di design della libreria
• Utilizzo di primer non compatibili
• Under- o overclustering

Effettuare il troubleshoot degli errori al ciclo 1

Per assicurarsi che i sistemi di fluidica, temperatura e movimento dello strumento funzionino come previsto, eseguire innanzitutto un controllo del sistema (System Check) sullo strumento, come descritto nella guida di sistema del MiSeq:

1. Effettuare un lavaggio successivo alla corsa (post run wash), come richiesto dallo strumento
2. Riavviare lo strumento (Power cycle), come descritto nella guida dello strumento (System Guide)
3. Selezionare gestisci strumento (Manage Instrument), quindi selezionare verifica di sistema (System Check)
4. Slezionare tutti i test di movimento (motion tests), prime reagent lines, ed entrambi i test di incremento termico (thermal ramping) e di volume (volume tests)

Una volta che i test sono stati completati, selezionare mostra dettagli (Show Details) nell’angolo in basso a sinistra dello schermo per avere una lista completa dei risultati. Se i test di volume falliscono in ogni posizione diversa dalla posizione PR2, o se almeno uno degli altri test fallisce, contattare il supposto tecnico dell’Illumina a techsupport@illumina.com per ricevere ulteriore assistenza.

Se la verifica del sistema viene superata, l'errore potrebbe essere dovuto a un problema con la libreria, o con i reagenti. Per indagare sui problemi più comuni:

• Controllare le date di scadenza ed il corretto stoccaggio dei kit dei reagenti
• Assicurarsi che il design della libreria sia compatibile per l'esecuzione su piattaforme Illumina
• Controllare la qualità e la quantificazione della libreria usando i metodi consigliati da Illumina
• Accertarsi che i primer personalizzati (custom primers) siano compatibili con la temperatura di allineamento di 65 °C per sequenziamenti con il MiSeq
• Accertarsi che i primer personalizzati vengano aggiunti ai pozzetti corretti della cartuccia (aggiunti ai pozzetti di primer esistenti senza alcuna modifica alla sample sheet, o aggiunti ai pozzetti per i custom primer, indicando nella sample sheet che vengono utilizzati primer personalizzati)

Se non ci sono problemi evidenti con la libreria o con i reagenti, ripetere la corsa aggiungendo il 20% della libreria PhiX di controllo. Questo funzionerà da controllo positivo durante la clusterizzazione della corsa successiva, in modo da determinare se l'errore precedente fosse stato causato da un problema non identificato nella libreria.

Se si verifica un errore al ciclo 1 nella corsa successiva, contattare il supporto tecnico dell’Illumina all'indirizzo techsupport@illumina.com per ulteriore assistenza.

Risorse aggiuntive:

MiSeq System Custom Primers Guide
Spiking custom primers into the Illumina sequencing primers
MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide