11/25/20
La normalisation des librairies est le processus de dilution des librairies de concentrations variables à une même concentration avant de les regrouper, assurant ainsi une distribution de lecture uniforme pour tous les échantillons. Ces bonnes pratiques de normalisation (ou homogénéisation) peuvent être utilisées pour toute préparation de librairies Illumina nécessitant une normalisation manuelle. Les étapes de la normalisation sont les suivantes:
Certains kits de préparation de librairie, tels que Nextera XT et Nextera DNA Flex, offrent une approche de normalisation basée sur les billes (bead-based normalization). La normalisation manuelle n'est alors pas nécessaire puisque celle-ci est réalisée par les billes. Cependant, lorsque la quantité initiale est inférieure à 100 ng pour Nextera DNA Flex ou que le rendement final de la librairie est inférieur à 10–15 nM pour Nextera XT, la normalisation par les billes n'est pas compatible. Dans ces situations, il est nécessaire d'effectuer une normalisation manuelle.
Déterminer la taille de votre librairie
Valider la taille de la librairie en mesurant les échantillons sur un bio-analyseur ou un analyseur de fragments. Cette étape offre également une visibilité sur les problèmes de librairie possibles, tels que les dimères d’amorces (adapter dimers) ou des tailles de librairies inattendues.
Quantifier vos librairies
Quantifier la librairie à l'aide de la méthode de quantification recommandée, comme indiquée dans le guide de préparation de la librairie, résumée dans le bulletin Library Quantification and Quality Control Quick Reference Guide.
Cette valeur obtenue en ng / µl doit être convertie en nM, en utilisant la taille moyenne de la librairie obtenue à partir du bioanalyseur ou de l'analyseur de fragments, et du bulletin Converting ng/µl to nM When Calculating dsDNA Library Concentration.
Planifier vos calculs de dilution
La normalisation de la concentration se produit dans cette étape. La dilution peut être effectuée en utilisant de l'eau de laboratoire ou du Tris-HCl 10 mM pH 8,5.
(C1) (V1) = (C2) (V2)
C1 = concentration de la solution initiale
V1 = volume de la solution initiale (qui sera diluée)
C2 = concentration de la solution finale
V2 = volume souhaité de solution finale
Pour avoir une représentation plus uniforme des échantillons et une densité de cluster plus fiable, assurez-vous que tous les volumes pipetés soient d'au moins 2 µl. Un pipetage inférieur à 2 µl peut introduire des erreurs de concentration importantes. Ajustez les calculs pour vous assurer que les volumes appropriés sont respectés. Pour les librairies hautement concentrées, utilisez une ou plusieurs concentrations intermédiaires.
Par exemple, les calculs suivants montrent comment diluer 3 librairies (avec différentes concentrations initiales de 15 nM, 20 nM et 50 nM) à une concentration finale de 4 nM dans un volume final de 15 µl pour chaque librairie.
| Concentration initiale |
Volume d’ADN stock (pour une concentration de 4 nM |
Volume de diluent (pour un volume final de 15 ul) |
|---|---|---|
| 15 nM | 4 ul | 11 ul |
| 20 nM | 3 ul | 12 ul |
| 50 nM* | 1,2 ul | 13,8 ul |
* L'exemple de la librairie à 50 nM n'utilise que 1,2 µl d'ADN stock pour se diluer jusqu'à une librairie de 4 nM. Pour des résultats plus précis, une dilution intermédiaire de 20 nM est nécessaire pour atteindre au moins un volume de pipetage de 2 µl.
| Dilution intermediaire | Dilution finale | |||
|---|---|---|---|---|
| Concentration initiale |
Volume d’ADN stock (pour une concentration intermédiaire de 20 nM) |
Volume de diluent (pour un volume final de 15 ul) |
Volume d’ADN intermédiaire à 20 nM (pour une concentration finale de 4 nM) |
Volume de diluent (pour un volume final de 15 ul) |
| 50 nM | 6 ul | 9 ul | 3 ul | 15 ul |
Regrouper les librairies normalisées
Regroupement volumétrique : il s’agit de combiner des volumes égaux de chaque librairie normalisée dans un microtube et pipeter doucement le contenu de haut en bas 10 fois pour bien homogénéiser.
L’échantillon normalisé (Pool) est maintenant prêt à être dénaturé et séquencé. Pour des instructions détaillées sur les procédures de dénaturation, utilisez le guide de dénaturation et de dilution de la plateforme approprié: