Les erreurs qui se produisent durant ou après le premier cycle sur un MiSeq indiquent qu'il peut y avoir une intensité de cluster insuffisante pour que l'instrument trouve la meilleure hauteur de camera lors de la mise au point.
Messages d'erreur potentiels:
- Best focus not found
- Best focus is too near the edge of range
- No usable signal found, it is possible clustering has failed
- Through-focus peak did not exceed SNR threshold
- Z Motor attempt to move outside soft limits
Les causes possibles reliées à l'instrument:
- Mauvaise livraison des réactifs impliqués dans la génération de clusters ou la chimie d’incorporation de la première base
- Problèmes de contrôle de température sur la Flow Cell
- Problèmes de système optique (rarement)
Les causes possibles relié à la librairie et aux réactifs sont:
- Utilisation de réactifs périmés ou mal stockés
- Problèmes de conception et / ou de qualité / quantification des librairies
- Mauvaise hybridation de l'amorce (primer) de read 1 causé par une mauvaise conception de librairies
- Utilisation d'amorces (primers) incompatibles
- Sous- ou sur-clustering
Dépannage des erreurs au cycle 1
Pour vous assurer que les systèmes de fluidique, de température et de mouvement de l'instrument fonctionnent comme prévu, effectuez d'abord une vérification du système sur l'instrument, comme décrit dans le MiSeq System Guide:
- Effectuez le lavage après le run comme demandé par l'instrument
- Éteignez et rallumez l'instrument comme décrit dans le Guide du système
- Accédez à Manage instrument, puis sélectionnez System Check
- Sélectionnez tous les motion tests, primer reagent lines et les tests de thermal ramping et les Volume tests
Une fois les tests terminés, sélectionnez Show details dans le coin inférieur gauche de l'écran pour obtenir une liste complète des résultats. Si le test de volume échoue dans une position autre que la position PR2, ou si l'un des autres tests échoue, contactez le support technique d'Illumina à techsupport@illumina.com.
Si les vérifications du système ont réussit, l'échec peut être dû à un problème avec la librairie ou les réactifs. Pour enquêter sur les problèmes les plus courants:
- Vérifiez les kits de réactifs pour les dates d'expiration et le stockage approprié
- Assurez-vous que la conception de la librairie est compatible avec les plateformes Illumina
- Vérifiez la qualité et la quantification de la librairie en utilisant les méthodes recommandées par Illumina
- Assurez-vous que les Custom primers (amorces personnalisées) sont compatibles avec la température de annealing (hybridation) de 65°C pour le MiSeq
- • Assurez-vous que des amorces personnalisées sont ajoutées aux puits de cartouche appropriés (dans les puits d'amorçage existants sans modification de la sample sheet, ou ajoutées aux puits d'amorces personnalisés avec la sample sheet indiquant que des amorces personnalisées sont utilisées)
S'il n'y a aucun problème apparent avec la librairie ou les réactifs, répétez le run avec un spike-in de 20% de PhiX. Cela agira comme un contrôle positif pour le clustering du run suivant afin de déterminer si l'erreur précédente été causée par un problème de bibliothèque.
Si une erreur se produit au cycle 1 du prochain run, contactez le support technique d'Illumina (techsupport@illumina.com) pour une assistance supplémentaire.
Additional Resources: