Un sequencing accurato di librerie a bassa diversità (low diversity libraries) su NextSeq 500/550 e MiniSeq richiede esperimenti ben progettati e pipelines informatiche. Un classico esempio di librerie a bassa diversità è rappresentato dal metodo di preparazione di librerie basato su ampliconi, come la metagenomica 16S. Queste librerie tendono ad avere sequenze di DNA che iniziano nella stessa posizione - il sito di legame della sonda - e sono per lo più identiche. Un locus rappresentato singolarmente causa un bias nella composizione di basi che può cambiare drasticamente da ciclo a ciclo.

I sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq utilizzano una chimica di sequenziamento a due canali )2-channel sequencing chemistry), per questo è importante avere tutte le quattro basi del DNA rappresentate ad ogni ciclo di sequenziamento. Questo permette al software di indentificare correttamente i cluster di DNA ed registrare le basi accuratamente. Per soddisfare questo requisito, in caso si utilizzi una libreria a bassa diversità, raccomandiamo design sperimentali che forniscano diversità ad ogni ciclo utilizzando i seguenti metodi:

• Utilizzare la strategia di indexing per aggiungere alla corsa campioni multipli indicizzati, provenienti da varie applicazioni.
  • Campioni indicizzati provenienti da applicazioni diverse, come sequenziamento di ampliconi umani, enrichment, o sequenziamento whole-genome, possono essere utilizzati per bilanciare la diversità della libreria.
  • Per ottenere risultati migliori, sequenziare campioni multipli nella stessa flow cell utilizzando index singoli o doppi.


• Aggiungere campioni whole-genome (ad esempio PhiX) alla corsa.
  • Un buon punto di partenza consiste nell’utilizzare il 50% di PhiX e successivamente abbassare la quantità in base ai risultati di qualità dell’analisi primaria e secondaria. La presenza del campione PhiX fornisce la diversità di base necessaria da ciclo a ciclo.


• Cercare di caricare entro l'intervallo di densità del cluster (cluster density) consigliato per i sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq, secondo le linee guida sulla densità del cluster per le piattaforme di sequenziamento Illumina (Cluster density guidelines for Illumina sequencing platforms).
  • Per i reagenti MiniSeq la densità ottimale di cluster grezzi è di 170-220 K / mm2.
  • Per i reagenti NextSeq 500/550 la densità ottimale di cluster grezzi è di 170-220 K / mm2.

Le raccomandazioni in questo bollettino consentono ai sistemi NextSeq 500/550 e MiniSeq di sequenziare librerie a bassa diversità.