Nel sequenziamento di librerie con bassa diversità nucleotidica, utilizzando flow cell di tipo non-patterned, la composizione sbilanciata dei nucleotidi può impattare negativamente sulla registrazione del modello dei cluster, sui punteggi Q30, e sull’output dei dati.

Per maggiori informazioni sull’importanza della diversità nucleotidica nel sequenziamento su piattaforme Illumina, consultare il bollettino What is nucleotide diversity and why is it important?

Per compensare la bassa diversità nucleotidica nelle librerie, Illumina raccomanda di aggiungere la libreria di controllo PhiX v3 (FC-110-3001, comunemente indicata come “PhiX”) per il sequenziamento. La libreria di controllo PhiX v3 ha una composizione nucleotidica varia (45% GC e 55% AT) che fornisce, durante ogni ciclo di sequenziamento, i segnali fluorescenti bilanciati che mancano in librerie di campioni a bassa diversità. Questo, a sua volta, aiuta la registrazione dei cluster e migliora la qualità generale della corsa.

Per maggiori informazioni sull’utilizzo della libreria di controllo PhiX v3, fare riferimento al bollettino What is the PhiX Control v3 Library and what is its function in Illumina Next Generation Sequencing?

La seguente tabella elenca la percentuale di PhiX, che Illumina raccomanda di aggiungere (spike-in), quando si corrono librerie a bassa diversità nelle piattaforme di sequencing e con la versione del software di controllo indicate.

† Le differenza nell’efficienza di clustering tra PhiX e la libreria di campioni può influenzare la percentuale di PhiX da aggiungere, necessaria per ottenere le percentuali allineate di PhiX indicate. Ad esempio, potrebbe essere necessaria una quantità maggiore di PhiX se la libreria di campioni clusterizza in maniera più efficiente di PhiX. Inviare una email al supporto tecnico techsupport@illumina.com per domande riguardo la vostra particolare libreria e piattaforma.

*PhiX può essere ulteriormente regolato in base alla sperimentazione. Illumina consiglia di iniziare con percentuali di spike-in più elevate e di ridurle in base alle prestazioni della corsa.

Domande frequenti:

1. Può la libreria di controllo PhiX v3 fornire un'elevata diversità nucleotidica per indici a bassa diversità?
   No, la libreria di controllo PhiX v3 non è indicizzata e non bilancia i segnali per le letture dell'indice.
2. Ci sono altre considerazioni per il sequenziamento delle librerie a bassa diversità?
   Ridurre la concentrazione di caricamento della libreria per raggiungere una densità dei cluster del 30–40% al di sotto dell'intervallo ottimale per la versione chimica e la piattaforma utilizzate. La quantità ottimale di riduzione richiesta deve essere determinata empiricamente. Per ulteriori informazioni, consultare:
   Cluster density guidelines for Illumina sequencing platforms
   Optimizing Cluster Density on Illumina Sequencing Systems