Ottenere una densità di cluster ottimale è fondamentale per un sequenziamento di alta qualità eseguito sulle piattaforme MiniSeq, MiSeq, NextSeq 500/550, e HiSeq 2500. Quando si utilizzano non-patterned flow cells, la densità di cluster ha un impatto significativo sulla performance della corsa, soprattutto in termini di qualità e quantità totale di dati generati (output). In condizioni di undeclustering viene prodotta una minore quantità di dati che tuttavia risultano di alta qualità. Al contrario, la condizione di overclustering può comportare il fallimento della corsa, una bassa performance della stessa, valori di Q30 più bassi, produzione di artefatti del sequenziamento e un minore ammontare di dati in output. Il presente bollettino riassume le risorse e le best practices da adottare per evitare le condizioni di underclustering e overclustering, al fine di ottenere una adeguata e consistente densità di cluster.
- Il controllo qualità e una quantificazione accurata delle librerie sono step fondamentali che, se non effettuati, risultano tra le cause più comuni di una densità di cluster inconsistente e non ottimale. Per il controllo delle librerie preparate con kit Illumina seguire i metodi elencati nel bollettino Library Quantification and Quality Control Quick Reference Guide
- Per diluire e denaturare le librerie seguire le linee guida più aggiornate e specifiche per ciascuno strumento:
- Di seguito sono elencate le best practices per la denaturazione delle librerie:
- La soluzione stock NaOH 2N deve avere un pH >12,5 prima di procedere con la diluizione. Accertarsi del corretto pH della soluzione stock prima di diluire le librerie.
- Per la denaturazione delle librerie preparare una soluzione di NaOH de novo appena prima dell'uso.
- Per evitare che errori di pipettamento di piccoli volumi abbiano conseguenze sulla concentrazione finale della soluzione di NaOH, preparare almeno 1 ml di soluzione diluita de novo.
- Per migliori risultati, scongelare i reagenti per il sequenziamento prima di denaturare e diluire le librerie. Per ulteriori istruzioni, prendere visione della guida di sistema dello strumento in uso.
- Seguire la guida "Denature and Dilute Libraries" specifica per lo strumento in uso.
- Per le serie HiSeq 2500 e MiSeq è importante che la concentrazione della soluzione finale di NaOH non sia superiore a 1 mM dopo averla diluita con HT1. Concentrazioni di NaOH superiori a 1 mM inibiscono l'efficienza di ibridazione del templato.
- Quando si denaturano le librerie per le serie NextSeq 500/550 e MiniSeq, utilizzare 200 mM Tris-HCl a pH 7.0 per assicurarsi che l'idrossido di sodio (NaOH) sia completamente idrolizzato nella soluzione finale. In questo modo l'ibridazione del templato non verrebbe inficiata anche qualora la concentrazione finale di NaOH fosse superiore a 1 mM (vedere le guide per la denaturazione e diluizione delle serie 500/550 and MiniSeq sopra riportate).
- Con librerie altamente strutturate o ricche in G-C la consistenza della densità di cluster migliora quando la libreria è denaturata termicamente prima di essere caricata sullo strumento. Questo metodo è opzionale per altre librerie
- Dopo la denaturazione della libreria con NaOH e la diluzione in HT1 fino alla concentrazione finale di caricamento, incubare la libreria diluita a 96°C per 2 minuti utilizzando un blocco riscaldante.
- Dopo l'incubazione termica, invertire la provetta 1-2 volte per mischiare i reagenti.
- Spostare velocemente la libreria in un bagno di ghiaccio per 5 minuti. Il passaggio di raffreddamento veloce aiuta a mantenere la libreria nella sua forma a singolo filmento (single strand).
- Procedere immediatamente con lo step di cluster generation.
- Considerare la lunghezza media della libreria. Dal momento che il processo di clustering amplifica preferenzialmente librerie più corte in un mix di frammenti, librerie più grandi tendono a generare cluster meno efficientemente rispetto a librerie più piccole. Il documento tecnico Nextera Library Validation and Cluster Density Optimization riporta le linee guida per le concentrazioni di caricamento basate sulla lunghezza media delle librerie.
- Debita attenzione è necessaria quando si sequenziano librerie a bassa diversità (low-diversity libraries) al fine di ottenere un'adeguata densità di cluster e dati di buona qualità. Per le linee guida relative al sequenziamento di low-diversity libraries, prendere visione del relativo documento tecnico dello strumento in uso: MiSeq, HiSeq, NextSeq, and MiniSeq.