NGS 워크플로우 단계

라이브러리 준비는 귀하의 NGS 워크플로우 성공에 중요합니다. 이 단계는 DNA 또는 RNA 샘플을 시퀀서에 적합하도록 준비합니다. 시퀀싱 라이브러리는 일반적으로 DNA 절편화 및 두 말단 모두에 특수 어댑터를 추가하여 생성됩니다. Illumina 시퀀싱 워크플로우에서, 이러한 어댑터들은 DNA 절편이 플로우 셀에 결합하도록 하는 상호보완하는 시퀀스를 포함합니다. 절편은 이후 증폭되고 정제될 수 있습니다.

리소스를 보존하기 위해, 여러 라이브러리가 함께 통합되고 동일한 런(run)에서 시퀀싱될 수 있는데, 이것은 멀티플렉싱(multiplexing)이라고 알려진 프로세스입니다. 어댑터 라이게이션(ligation)이 진행되는 동안, 고유한 인덱스 시퀀스, 또는 “바코드”가 각 라이브러리에 추가됩니다. 이러한 바코드들은 데이터 분석 동안 라이브러리들을 구별하기 위해 사용됩니다.

라이브러리 준비 리소스

NGS 워크플로우의 시퀀싱 단계 동안, 라이브러리는 플로우 셀에 로딩되고 시퀀서에 배치됩니다. DNA 절편의 클러스터는 클러스터 생성이라는 프로세스에서 증폭되어, 수백만 개의 단일 가닥 DNA 복제를 초래합니다. 대부분의 Illumina 시퀀싱 기기에서, 클러스팅은 자동적으로 발생합니다.

Sequencing by synthesis(SBS)라는 프로세스에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 자연적 상보성을 통해 DNA 템플릿 가닥에 결합합니다. 각 뉴클레오티드는 형광 태그 및 다음 염기의 포합을 차단하는 가역적 종결자(reversible terminator)를 포함합니다. 형광 시그널은 다음 염기가 결합할 수 있도록 어떤 뉴클레오티드가 추가되고 어떤 종결자가 절단되었는지 나타냅니다.

DNA 가닥을 정방향 판독한 후, 리드는 씻겨나가며 과정은 역방향 가닥으로 반복됩니다. 이 방법을 페어드 엔드 시퀀싱이라고 합니다.

시퀀싱 후, 기기 소프트웨어는 뉴클레오티드(베이스 콜링이라는 과정) 및 이러한 베이스 콜의 예측된 정확성을 식별합니다. 데이터 분석 동안, 귀하는 시퀀싱 데이터를 표준 분석 도구로 불러오거나 귀하만의 파이프라인을 설정할 수 있습니다.

오늘, 귀하는 바이오인포매트릭스 교육 또는 추가 실험실 직원 없이 NGS 데이터를 분석할 수 있는 직관적인 데이터 앱을 사용할 수 있습니다. 이러한 도구들은 시퀀스 정렬, 변이 콜, 데이터 시각화 또는 해석을 제공합니다.