인덱스 호핑
멀티플렉싱 런에서 인덱스 호핑 최소화
인덱스 스위칭과 관련된 시퀀싱 리드 오정렬을 방지하기 위한 팁 및 모범 사례
인덱스 호핑이란?
인덱스 호핑(index hopping) 또는 인덱스 스위칭(index switching)은 샘플 멀티플렉싱이 개발된 시점부터 NGS 기술에 영향을 주는 것으로 알려진 현상입니다.1 인덱스 호핑은 예상 인덱스에서 멀티플렉싱된 풀의 다른 인덱스로 라이브러리를 잘못 할당하는 특정 유형의 오할당을 유발합니다.
인덱스 호핑은 드물게 발생하지만, 패턴화된 플로우 셀을 사용하지 않는 기기에 비해 배제 증폭 화학 반응이 있는 패턴화된 플로우 셀을 사용하는 기기에서 약간 높은 수준으로 보여질 수 있습니다. 패턴화된 플로우 셀 시스템에서 인덱스 호핑 수준은 라이브러리 유형, 품질, 취급 방식에 따라 다르지만 0.1~2%가 일반적입니다.
멀티플렉싱으로 역량 증가
차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS) 기술의 개선으로 시퀀싱 속도와 데이터 아웃풋이 크게 향상되어 현재 시퀀싱 플랫폼의 샘플 처리량이 엄청나게 증가했습니다. 이렇게 증가된 역량을 활용하는 데 있어 핵심은 라이브러리 준비 도중 각 DNA 절편에 인덱스라는 고유한 시퀀스를 추가하는 멀티플렉싱입니다. 이 멀티플렉싱을 사용하면 한 번의 시퀀싱 런 중에 많은 수의 라이브러리를 풀링하고 동시에 시퀀싱할 수 있습니다.
풀링된 라이브러리의 시퀀싱 리드는 최종 데이터 분석 전에 디멀티플렉싱이라는 프로세스에서 컴퓨터로 식별 및 분류되므로, 멀티플렉싱으로 처리량이 증가하면 복잡성 계층이 추가됩니다. 그러나 멀티플렉싱을 사용하면 사용된 라이브러리 준비 방법이나 시퀀싱 시스템에 관계없이 인덱스 호핑이 발생할 가능성이 있습니다. 인덱스 호핑으로 인해 디멀티플렉싱 중에 잘못된 인덱스에 시퀀싱 리드가 할당되면 오정렬이 발생할 수 있습니다.
인덱스 호핑의 영향은?
인덱스 호핑이 발생할 수 있고 패턴화된 플로우 셀을 사용하는 기기에서 약간 높은 수준으로 보여질 수 있지만 대부분의 애플리케이션에서는 효과가 제한적이며 백그라운드 호핑 리드는 노이즈로 필터링될 수 있습니다. 더 높은 수준의 무료 어댑터가 있는 라이브러리에서는 더 높은 수준의 인덱스 호핑이 표시됩니다. 그러나 고유한 듀얼 인덱싱 조합을 사용하면 예상치 못한 조합이 미확인으로 할당되므로 다운스트림 분석에서 호핑된 리드가 제거됩니다.
인덱스 호핑을 최소화하는 방법
인덱스 호핑 수준과 효과를 최소화하려는 고객은 다음 라이브러리 준비 팁과 모범 사례를 따라야 합니다.
- 고유한 듀얼 인덱싱(UDI) 풀링 조합 사용(고유한 i5 및 i7 인덱스)
- 라이브러리 준비에서 무료 어댑터 제거
- -20°C에서 라이브러리를 개별적으로 보관
- 시퀀싱 전 라이브러리 풀링
듀얼 인덱스 시퀀싱
시퀀싱을 위해 라이브러리를 풀링할 때 조합된 듀얼 인덱스보다 고유한 듀얼 인덱스를 사용하는 것이 좋습니다. 고유한 듀얼 인덱싱은 호핑된 리드를 필터링하여 인덱스 호핑을 완화합니다.
고유한 듀얼 인덱싱에 대해 더 알아보기고유한 분자 식별자
고유한 분자 식별자(Unique molecular identifier, UMI)는 시퀀싱 중에 오류 수정과 정확도 향상을 제공하는 일종의 분자 바코드입니다. UMI를 사용한 시퀀싱은 위양성(false-positive) 변이 콜의 비율을 줄이고 변이 검출 민감도를 높일 수 있습니다.
UMI에 대해 더 알아보기인덱스 호핑 완화
고유한 듀얼 인덱스를 통해 연구자는 예상치 못한 조합을 제거하고 올바른 인덱스 조합이 있는 ‘진짜’ 데이터에만 집중할 수 있습니다. Illumina는 제공하는 고유한 듀얼 인덱스의 수를 확장하고 있습니다. 고유한 듀얼 인덱스와 호환되는 라이브러리 준비 제품의 예는 다음과 같습니다.
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참고 문헌
- Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 2012:2513–2524.